作者：米勒之声

转载来源：麻醉科

本文原载于《中华麻醉学杂志》2022年第3期

胶质瘤是最常见的原发性恶性颅内肿瘤之一，占中枢神经系统原发性恶性肿瘤的81%，其浸润性生长，侵袭力强，恶性程度高，使得胶质瘤患者的5年生存率极低[1]。目前胶质瘤患者的标准治疗方法为手术切除后辅以放射治疗和化学治疗。血脑屏障是脑胶质瘤生长的天然保护屏障，大部分抗肿瘤药物因无法穿透血脑屏障而无法用于脑胶质瘤的治疗，而抗肿瘤药物替莫唑胺能够通过血脑屏障，是少数具有中枢神经系统活性的抗肿瘤药物之一，因而成为胶质瘤化疗的一线药物。研究表明，胶质瘤细胞对替莫唑胺的敏感性易受多种因素影响[2,3]，进而影响化疗效果和患者预后。丙泊酚作为临床使用最广泛的静脉麻醉药物之一，常用于胶质瘤手术的麻醉诱导、维持以及术后镇静。有研究显示，丙泊酚对化疗药物的作用存在影响[4,5]。本课题组前期研究表明，丙泊酚可通过上调胶质瘤细胞长链非编码RNA-生长阻滞特异性转录因子5(lncRNA-GAS5)表达抑制胶质瘤细胞活力、侵袭力和迁移能力[6]。lncRNA-GAS5参与替莫唑胺诱导的DNA损伤和细胞毒性作用，对胶质瘤细胞化疗敏感性有影响[7]。本研究拟评价丙泊酚对胶质瘤细胞替莫唑胺敏感性的影响及lncRNA-GAS5在其中的作用，为临床胶质瘤手术患者镇静药物的选择提供参考。

材料与方法

主要试剂与仪器

人胶质瘤细胞系U251细胞(上海中国科学院细胞库)，丙泊酚(批号：X20095A，AstraZeneca公司，意大利)，替莫唑胺(批号：0001104512，MerckSharp&Dohme公司，英国)，DMEM培养基和胎牛血清(Gibco公司，美国)，Lipofectamine©3000试剂盒(ThermoFisherScientific公司，美国)，RNAisoPlus试剂盒(Takara公司，日本)，Hifair©Ⅱ1stStrandcDNASynthesisKit(gDNAdigesterplus)试剂盒、HieffUNICON©UniversalBlueqPCRSYBRGreenMasterMix(上海翌生生物科技股份有限公司)，CCK-8试剂盒(碧云天生物技术有限公司)，AnnexinV-FITC凋亡试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公司)，Transwell小室和Matrigel胶(Corning公司，美国)，兔抗c-Myc、P21、谷胱甘肽-S-转移酶Mu3(GSTM3)及β-actin抗体(AffinityBiosciences公司，美国)，辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗兔IgG抗体(碧云天生物技术有限公司)。Real-TimePCR仪(AppliedBiosystems公司，美国)，多功能酶标仪(ThermoFisher，美国)，CytoFLEX流式细胞仪(Beckman公司，美国)。

药物配制

丙泊酚药液用细胞培养基稀释，配置成8μg/ml的丙泊酚的实验培养基待用。替莫唑胺药粉20mg，添加1.288ml二甲基亚砜溶液，超声溶解成80mmol/L母液。根据实验需要进行分装，置入4℃冰箱保存备用。实验使用时用细胞培养基将替莫唑胺母液稀释为400μmol/L溶液。

细胞培养及分组

U251细胞接种于含10%FBS和1%双抗的DMEM培养基中，置于37℃，5%CO2及饱和湿度培养箱中培养。待细胞达到70%~80%融合时，用0.25%胰蛋白酶消化传代，按实验要求分别接种于6孔板、24孔板或96孔板内。采用随机数字表法分为5组(n＝30)：对照组(C组)、替莫唑胺组(T组)、丙泊酚+替莫唑胺组(PT组)、无意义siRNA+丙泊酚+替莫唑胺组(NPT组)和lncRNA-GAS5-siRNA+丙泊酚+替莫唑胺组(GPT组)。C组为常规条件下正常培养的U251细胞；T组U251细胞培养基内加入400μmol/L替莫唑胺培养48h；PT组U251细胞先使用8μg/ml丙泊酚培养6h，之后更换培养基，再使用400μmol/L替莫唑胺培养48h；NPT组和GPT组U251细胞先分别接受无意义siRNA和GAS5-siRNA转染，48h后处理同PT组。

siRNA转染

GAS5-siRNA及无意义siRNA由重庆威斯腾生物医药科技有限责任公司设计合成。GAS5-siRNA的序列为：5′-GCAAGCCTAACTCAAG-CCA-3′；无意义siRNA的序列为：5′-UUCUCCGAA-CGUGUCACGUUUTT-3′。使用Opti-MEM减血清培养基稀释siRNA，按照Lipofectamine©3000试剂盒说明书进行转染：U251细胞接种于6孔板，加入2ml完全培养基，CO2培养箱37℃培养使细胞铺展。待细胞密度在80%~90%时，用无抗生素培养基替换完全培养基。用Opti-MEM培养基稀释Lipofectamine©3000试剂，分别加入稀释后的GAS5-siRNA和无意义siRNA，室温孵育5min制成siRNA-脂质体复合物。将无意义siRNA-脂质体复合物加入N组、NT组和NPT组U251细胞，将GAS5-siRNA-脂质体复合物加入G组、GT组和GPT组U251细胞，转染48h。收集2组细胞用于后续实验，使用qRT-PCR法测定U251细胞内lncRNA-GAS5的表达，确定转染效率。

QRT-PCR法测定lncRNA-GAS5的表达

使用RNAisoPlus试剂盒提取不同药物处理后的U251细胞的总RNA，再按照Hifair©Ⅱ1stStrandcDNASynthesisKit(gDNAdigesterplus)试剂盒说明书合成cDNA，逆转录条件：25℃5min，42℃30min，85℃5min。取1μlcDNA按照HieffUNICON©UniversalBlueqPCRSYBRGreenMasterMix试剂盒说明书进行扩增。使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内参。GAPDH上游引物序列：5′-GGGAAGGTGAAGGTCGGA-GT-3′，下游引物序列：5′-GGGGTCATTGATGGCAACA-3′；lncRNA-GAS5上游引物序列：5′-CTTGCCTGGACCAGCTTAAT-3′，下游引物序列：5′-CAAGCCGACTCTCCATACCT-3′。扩增反应条件为：95℃预变性2min，95℃10s，60℃30s，40个循环。使用2-ΔΔCT法计算相对表达量。

CCK-8法测定细胞存活率

将U251细胞以8×104/ml密度接种于96孔板，每孔100μl，每组设9复孔，同时设置空白培养基孔。进行药物分组处理后，每孔加入CCK-8溶液10μl，37℃孵育4h。使用酶标仪测定在450nm处的吸光度值(OD)。细胞生存率＝(OD实验组-OD空白组)÷(OD对照组-OD空白组)×100%。

流式细胞仪测定细胞凋亡率将不同处理的各组U251细胞每组取6孔，用胰酶消化2min，离心5min，弃上清，收集细胞，调整细胞浓度至1×106/ml，加入AnnexinV-FITC5μl混匀，室温避光孵育10min，再加入碘化丙啶5μl，冰浴避光放置。随即进行流式细胞仪检测，激发波长488nm，发射波长530nm，测定细胞凋亡率。

Transwell法测定细胞侵袭力

将Matrigel胶用无血清的细胞培养基1∶9稀释，取60μl稀释的Matrigel胶铺于孔径为8μm的Transwell小室，置于24孔板内，37℃放置3h使其固化。将处理后的各组U251细胞用1%FBS重悬并调整至2×105/ml，取200μl细胞悬液加入Transwell小室(上室)，在24孔板(下室)中加入500μl含10%FBS的细胞培养基。每组随机取6孔培养48h后，用棉球拭去上室中的基质胶和细胞。小室下表面浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定30min，0.1%结晶紫染色20min，清洗3遍，200倍显微镜下取中间和四周5个视野拍照并计数侵袭的细胞数，取平均值。

Westernblot法检测c-Myc、P21和GSTM3的表达

各组U251细胞分别接受相应处理后，每组取6孔加入细胞裂解液，4℃下离心15min，取上清液用BCA法测定蛋白浓度。取等量蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭液室温封闭1h。分别加入c-Myc、P21、GSTM3及β-actin的一抗(稀释度1∶1000)，4℃下孵育过夜。TBST清洗后加入HRP标记的二抗(稀释度1∶1000)，室温孵育1h。TBST清洗4次，ECL曝光液反应2min后凝胶成像系统成像。使用ImageJ软件计算灰度值，以β-actin作为内参蛋白，以目的蛋白与内参蛋白条带灰度值的比值反映目的蛋白的表达。

统计学处理

采用SPSS20.0软件进行分析，正态分布的计量资料以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

结果

与C组比较，其余4组细胞存活率降低，凋亡率升高，侵袭细胞数减少(P<0.01)；与T组比较，PT组和NPT组细胞存活率降低，凋亡率升高，侵袭细胞数减少(P<0.01)；与PT组比较，GPT组细胞存活率升高，凋亡率降低，侵袭细胞数增加(P<0.01)，NPT组上述指标比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1各组细胞存活率、凋亡率和细胞侵袭数的比较(n＝6，±s)

与C组比较，其余4组细胞c-Myc和GSTM3表达下调，P21和lncRNA-GAS5表达上调(P<0.01)；与T组比较，PT组和NPT组细胞c-Myc和GSTM3表达下调，P21和lncRNA-GAS5表达上调(P<0.05)；与PT组比较，GPT组细胞c-Myc和GSTM3表达上调，P21和lncRNA-GAS5表达下调(P<0.05)，NPT组上述指标比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2和图1。

表2各组细胞lncRNA-GAS5、c-Myc、GSTM3和P21表达的比较(n＝6，±s)

注：GSTM3为谷胱甘肽-S-转移酶Mu3，lncRNA-GAS5为长链非编码RNA-生长阻滞特异性转录因子5

注：GSTM3为谷胱甘肽-S-转移酶Mu3图1Westernblot法检测细胞c-Myc、GSTM3和P21表达的电泳图

讨论

全身麻醉时丙泊酚的血药浓度为4~8μg/ml，其稳态动脉血药浓度为4.4μg/ml[8]，胶质瘤手术时间为5~8h。前期实验选取1、4、8和12μg/ml丙泊酚孵育U251细胞，证实8μg/ml为有效浓度，故本研究选择该浓度丙泊酚处理6h进行处理。参照文献[7]，本研究选择浓度400μmol/L替莫唑胺培养48h进行处理。预实验中脂质溶剂对U251细胞生长未产生影响，故未设置对照组。研究表明，多种lncRNA能够影响胶质瘤细胞对替莫唑胺的敏感性[9,10]，其中lncRNA-GAS5参与替莫唑胺诱导的DNA损伤和细胞毒性作用，可增强胶质瘤细胞的化疗敏感性[7]。丙泊酚可上调胶质瘤细胞lncRNA-GAS5表达[5]。本研究结果表明，较单独使用替莫唑胺，丙泊酚复合替莫唑胺使U251细胞增殖减少，凋亡增加，侵袭力减弱，提示丙泊酚增强了胶质瘤细胞对替莫唑胺的敏感性。敲低lncRNA-GAS5表达后，丙泊酚的作用被部分逆转，提示lncRNA-GAS5在丙泊酚增强胶质瘤细胞对替莫唑胺敏感性的过程中发挥重要作用。

c-Myc是肿瘤细胞中的关键癌基因，并被确定在调节神经胶质瘤的形成和进展中发挥核心作用[11]。GSTM3过度表达与肿瘤的化疗耐药性有关[12]，在胶质瘤细胞中，GSTM3的表达水平被证明与胶质瘤恶性程度呈负相关[13]。细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂P21是G1期细胞周期调节剂，诱导细胞在G1期停滞，阻滞细胞进入S期，减少细胞分裂增殖，从而发挥抑癌作用[14]。本实验结果显示，替莫唑胺下调了c-Myc和GSTM3表达，上调了P21表达，丙泊酚加强了替莫唑胺的这种作用，而敲低GAS5表达减弱了替莫唑胺以及丙泊酚复合替莫唑胺的作用，提示丙泊酚可通过调控GAS5表达，下调c-Myc和GSTM3表达，上调P21表达，增强替莫唑胺对U251细胞的敏感性。综上所述，丙泊酚可增强胶质瘤细胞对替莫唑胺的敏感性，lncRNA-GAS5表达参与了这一过程。

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文中所涉及药物使用、疾病诊疗等内容仅供医学专业人士参考。

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编辑：MiLu.米鹭

校对：Michel.米萱

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